羟氨苄青霉素进入体内后药物分子中的内酰氨基立即水解成肽键，迅速和菌体内的转肽酶相结合，使之失去活性，从而影响菌体构建细胞壁，是细菌细胞迅速成为球形体而破裂溶解，菌体最终因为细胞壁缺失，水肿而胀裂死亡。对于大多数致病的革兰氏阳性和阴性细菌，具有很好的抑菌和杀菌作用。临床上可用于治疗肺炎链球菌、溶血性链球菌、葡萄球菌、粪肠球菌、大肠埃希菌、沙门菌属、流感嗜血杆菌引起的上呼吸道感染、泌尿生殖系统感染、皮肤软组织感染、下呼吸道感染等。还可以联合质子泵抑制剂，硝咪唑类抗菌药物根治幽门螺旋杆菌感染。